Con Cosimo I, iniziò la riqualificazione della città in senso monarchico. Una delle azioni in tal senso fu la riunificazione delle 13 più importanti magistrature della città Fiorentina in un unica sede denominata "Uffici" (Uffizi). Chiaramente questo serviva ad avere il controllo sulle loro attività. Il progetto di realizzare questi Uffici fu affidato al Vasari nel 1560. Nel progetto si doveva incorporare anche l'antica chiesa romanica di san Pier Scheraggio, la zecca vecchia dove dal 1866 ebbero anche sede le regie poste.

I veri e propri Uffici accessibili al pubblico e ad al lavoro erano quelli del piano terra con loggiato architravato con loggia a botte, il primo piano con larghe finestre per sfruttare per quando possibile ogni minuto di luce solare, mentre l'ultimo piano era riservato ad uso privato del Duca. Il Vasari adotta come criterio l'ordine dorico:  "più sicuro e più fermo degl'altri, [...] sempre piaciuto molto al signor duca Cosimo". Già cinque anni dopo, vennero completati i cosidetti Uffizi Lunghi ed il tratto che arriva e si affaccia sull'Arno. La parte stretta della "U" è un vero e proprio "fondale teatrale" classico, con la statua di Cosimo I al centro realizzata da Giambologna (1585). Le altre statue poste nel periodo, solo altre due di Vincenzo Danti, quelle del Rigore e dell'Equità del 1566. Le altre nicchie furono riempite solo dal 1835 con figure di Fiorentini famosi.

Nel 1565, Cosimo I, in occasione del matrimonio del Figlio Francesco con Giovanna d'Austria, venne commissionata la realizzazione di quello che oggi è conosciuto come il corridoio Vasariano. Passando per il ponte vecchio intorno alla torre del Mannelli che faceva parte del sistema difensivo del ponte e i cui proprietari fecero resistenza all'abbattimento, poi ancora davanti alla chiesa di santa felicita da a cui si poteva accedere con un balcone e prendere la messa senza scendere tra il popolo. delle grate potevano essere chiuse in caso di necessità. Infine lo sbocco del corridoio sul retro del palazzo dalla parte del giardino di Boboli.

"Nel 1574 quando il potere passò nelle mani di Francesco I de' Medici la direzione dei lavori venne affidata a Bernardo Buontalenti, che completò la fabbrica, insieme a Alfonso Parigi il vecchio, nel 1580. Tra il 1579 e il 1581 le volte della Galleria furono affrescate con motivi a "grottesca" da Antonio Tempesta e successivamente da Alessandro Allori, con cui collaborarono Ludovico Buti, Giovanmaria Butteri, Giovanni Bizzelli e Alessandro Pieroni". Subito di seguito iniziò ad utilizzare la loggia all'ultimo piano per realizzare una galleria che accoglieva le sue collezioni private composte da un po' ogni genere di curiosità e opere d'arte.

"Nel 1583 Francesco I fece trasformare la terrazza, sopra la Loggia dei Lanzi, in un giardino pensile, ora scomparso, dove la corte si riuniva ad ascoltare esibizioni musicali ed altri intrattenimenti. Sempre al Buontalenti spetta la realizzazione del teatro mediceo: un vano circondato da gradinate con nel mezzo il palco dei principi. Nel corso dei secoli il teatro è stato suddiviso in due piani: nel primo ora ha sede il Gabinetto Disegni e Stampe, nel secondo alcune sale della Galleria. Del teatro vero e proprio resta solamente il Vestibolo, dove a sinistra è quello che un tempo era il portale d'ingresso al teatro, oggi ingresso del Gabinetto Disegni e Stampe e di fronte le tre porte del Ricetto, su quella centrale, con le ante lignee intagliate con stemmi medicei, è il busto di Francesco I."
 

nel Corso dei secoli alcune stanze vennero attrezzate e modificate, ad esempio sulla terrazza sopra la Loggia dei Lanzi (lanzichenecchi), fu fatto costruire un giardino pensile, oggi scomparso. In un'ala invece il teatro reale, poi  ridiviso in tre piani per ricavarne altre stanze. Gli allestimenti interni rivisti diverse volte fino alla conformazione attuale. Da notare: dal tempo dell'alluvione del 1966 non sono stati presi provvedimenti contro le regolari e statisticamente ricorrenti alluvioni dell'Arno. Sono passati più di quarant'anni ed alla prossima alluvione il grosso delle opere stivate nei magazzini sottostanti saranno probabilmente visibili solo in fotografia.